Cell脂质降低成纤维细胞线粒体中环

民以食为天

随着快节奏的生活习惯，高热量快餐饮食和久坐不动等不良生活习惯会导致免疫代谢相关疾病。例如非酒精型脂肪肝（NASH）、糖尿病和肥胖就是一些非常普遍的代谢型炎症。作为一种影响全球四分之一的人口的常见亚健康疾病，除了生活与饮食生活习惯，非酒精型脂肪肝还与胰岛素抵抗和高脂血症等免疫代谢疾病高度相关。俗话说，民以食为天。如今成熟化的食品加工方案提高了现代人的生活品质。然而其中一些便捷性食品却潜在地影响现代人的健康。例如泡面等食品中含有棕榈油等物质，虽然纯棕榈油调节心脑血管健康，然而有报道指出棕榈酸对癌症转移的促进作用。今天介绍的研究阐明代谢紊乱如何转变为身体无法控制的炎症。

文章简介

TargetingMitochondria-LocatedcircRNASCARAlleviatesNASHviaReducingmROSOutput于年发表于Cell。这篇文章以非酒精性脂肪肝成纤维细胞受到外界脂质调控改变代谢偏好、影响线粒体功能入手，一步步解析脂质通过降低环状RNA调控线粒体通透性转换孔影响ROS生成和线粒体膜电位的详细分子机制。

文章介绍

1.炎症表型发现

成纤维细胞在多种疾病调节纤维化，对多种疾病非常重要。作者首先研究非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者的线粒体代谢紊乱。通过比较NAFLD与正常人的肝组织成纤维细胞的胞外酸化率（ECAR）和耗氧率（OCR），发现ATP的生产方式从线粒体氧化磷酸化向糖酵解倾斜。棕榈酸酯处理下，正常成纤维细胞同样能发生这种代谢改变。

电子传递链的质子泵产生一定的线粒体膜电位用于驱动ATP的生产。而线粒体膜电位的下降将导致线粒体的功能异常。作者发现NASH成纤维细胞的线粒体膜电位明显低于正常组织，同时伴随线粒体结构肿胀，暗示线粒体压力。而ROS又与线粒体压力相关。同时作者使用荧光染料发现NASH成纤维细胞的线粒体ROS（mROS）和细胞质ROS（cROS）显著增加。棕榈酸处理的正常成纤维细胞表现出类似于NASH成纤维细胞的ROS异常增加。此外使用抑制剂抑制mROS释放到细胞质，显著降低了cROS水平。而ROS抑制剂消除了NASH成纤维的促纤维化和促炎功能。上述现象表明暴露在脂质环境下的成纤维细胞表现出线粒体应激现象，产生大量mROS（并排出到细胞质），促进成纤维细胞活化。（图1）

图1mROS介导脂质相关的成纤维细胞促炎症表型

2.环状RNA

尽管线粒体环状RNA（mito-circRNAs）相对于细胞核环状RNA占比甚微，然而在NASH患者和非NAFLD患者的环状RNA表达谱中，11种持续下调的环状RNA中有4种来源于线粒体基因组。其中3种线粒体环状RNA在另一个患者队列里得到验证，并且证实主要位于线粒体，而非细胞质。作者使用之前搭建的线粒体靶向纳米颗粒平台（mito-NP），能够通过封装载体将环状RNA送入线粒体中。从而锁定hsa_circ_（SCAR，脂肪性肝炎相关circRNAATP5B调节因子）在NASH成纤维细胞的线粒体的表达能够显著减少cROS。这说明抑制mito-circRNAs可能对NASH成纤维细胞的激活起到促进作用。（图2）

图2脂质暴露环境导致成纤维细胞线粒体循环组学失衡

3.上下游相互作用

作者验证了内源性的SCAR是环状转录物，并非抑制的线性转录物，并定位于线粒体内。同时qRT-PCR显示正常成纤维细胞中SCAR环状转录物拷贝高于线性转录物的两倍。而NASH成纤维细胞环状和线性的SCAR均显著减少。

环状RNA具有RNaseR抗性，基于这个原理，作者发现在线粒体中的环状SCAR的含量明显高于胞质。SCAR源自宿主基因长第二个外显子的环化。因此作者将该外显子插入到环状RNA过表达载体并封装到mito-NP中，观察到具有RNaseR抗性的环状SCAR水平增加。此外显著降低了mROS与cROS的水平，逆转NASH成纤维细胞中的线粒体膜电位下降。而对ECAR/OCR的比例没有显著影响。说明线粒体环状SCAR能够抑制ROS产生并解除线粒体膜电位抑制。

鉴于脂质负担将导致mROS累积，作者关心脂质是否调节环状SCAR。实验发现棕榈酸酯处理显著降低环状SCAR表达水平，而通过mito-NP过表达能够消除脂质调控环状SCAR及其后续ROS和膜电位的影响。另外也抑制了棕榈酸酯处理导致的成纤维细胞活化。而在棕榈酸酯处理同时沉默环状SCAR能够进一步增强促纤维化表型。这说明mito-circRNASCAR在上游受到脂质的抑制，在下游功能是调节线粒体释放ROS并降低膜电位。（图3）

图3环状RNASCAR定位于线粒体并抑制成纤维细胞激活

4.分子相互作用机制

对于环状SCAR的具体生物学功能，作者首先通过在潜在ORF序列终止密码子前端插入3xFlag标签，没有观察到标记的蛋白，表明环状SCAR是非编码RNA。同时环状SCAR假定潜在结合的几种miRNA没有包含两个以上的结合位点，也不是由线粒体基因组转录。所有显然SCAR也不是miRNA海绵。过度表达环状SCAR对宿主基因也不存在明显变化，说明其功能不是转录本调节。

RNA结合蛋白在环状RNA的功能中起到关键作用。通过RNA下拉质谱分析鉴定到8中蛋白。其中最显眼的是mPTP的两个调节因子ATP5A和ATP5B。通过体外实验免疫沉淀作者发现ATP5B能够直接与环状SCAR结合。ATP5A通过与ATP5B的结合与环状SCAR相互作用。此外使用APEX标记、链霉亲和收集蛋白的方法验证了ATP5B、circRNASCAR和mito-NP位于相同的亚线粒体区室中，即基质和面向基质的内膜(matrix-APEX)，而不是膜间隙(IMS-APEX)或外膜(OMM-APEX)。进一步的作者发现截短型SCAR-能与ATP5B相互作用。突变型的SCAR破坏了在NASH成纤维细胞中与ATP5B的相互作用，并解除了ROS抑制。此外发现ATP5B结构域的ILQDYK部分与SCARSCAR-结合。（图4）

图4环状RNASCAR直接结合ATP5B

5.环状SCAR上下游调控分子机制

mPTP的开放降低了线粒体膜电位并增加mROS的产生和释放。而环状SCAR通过与ATP5B结合调节性抑制了mPTP上述功能。作者通过钙黄绿素验证了上述的发现。此外发现环状SCAR结合ATP5B破坏了mPTP主要的促进剂cypD与mPTP的相互作用。

通过生物信息学分析作者发现了PGC-1α调节环状SCAR转录。并且棕榈酸酯显着减少了PGC-1α。随后作者发现脂质诱导的内质网应激拮抗剂通过CHOP抑制PGC-1α依赖的环状SCAR表达。最后在小鼠模型中表达人类的环状SCAP抑制了ROS和细胞因子表达水平。并且这种治疗方式显著提高高脂肪饮食小鼠对葡萄糖和胰岛素的耐受，阻止体重增加，减少了肝脏纤维化和巨噬细胞浸润。并且在NASH患者中发现了环状SCAP与疾病进展的高度相关性。

小知识

01

JC-1是一种检测线粒体膜电位(mitochondrialmembranepotential)△Ψm的荧光探针。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体(monomer)，可以产生绿色荧光。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。

02

线粒体ROS（mROS）可以通过线粒体通透性转换孔（mPTP）释放的细胞质中，这也是细胞质ROS（cROS）主要来源。

03

RNaseR能几乎能消化所有线性RNA，因此能够用于富集环状RNA或套索结构RNA。

04

miRNA海绵（miRNAsponge）,海绵的意思是将miRNA吸收。由于miRNA没有蛋白产物，此前其对mRNA的抑制作用的检测无从下手。研究人员开发miRNA海绵，用于长效抑制miRNA。miRNA海绵是一种与miRNA反义的寡核苷酸链，能够与miRNA特异性结合，与mRNA竞争，从而解除miRNA对mRNA的抑制作用。

05

钙黄绿素AM是一种可用于测定大多数真核细胞的细胞活力的细胞可透过性染料。在活细胞中，非荧光钙黄绿素AM在通过细胞内酯酶进行乙酰氧基甲基酯水解后转化为绿色荧光钙黄绿素。

本文作者：一帆

责任编辑：一帆

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